如何选择无细胞蛋白表达系统

　与基于细胞的蛋白表达系统相比较，无细胞蛋白表达系统具有独特的优势，包括节约时间、提高具有功能的、可溶的、全长蛋白的总体产量。此外，无细胞蛋白表达系统更适用于激酶等毒性蛋白的表达、也可使用经过修饰的tRNA来进行标记，在某特定位点掺入非天然的氨基酸。同时，这些系统还可以用于高通量实验(1)。我们提供完备的无细胞蛋白表达系统，为研究者提供了多种选择，可用于进行蛋白的特征描述，包括免疫沉淀、Pull-down实验和酶学检测。

　　选择一个无细胞蛋白表达系统，最主要的几点考虑因素包括细胞提取物或裂解物的来源、模板以及期望的蛋白产量。本文介绍的信息可帮助研究者选择适合其实验体系和下游应用的无细胞蛋白表达系统。

考虑因素— 模板

　　在使用插入片断或载体进行真核细胞系统蛋白表达时，有以下几个因素需要考虑：(i)ATG起始密码子应该是位于转录起始位点下游的第一个ATG密码子；(ii)理想化而言，在启动子之后，ATG应该包含在Kozak共有序列之内；(iii)在模板序列的3'端应包含终止密码子；(iv)终止密码子之后应带有合成的多聚A尾(2)。此外，使用TNT® T7麦胚偶联系统(TNT® T7 Coupled Wheat Germ System)时，载体还应包含一个T7终止子序列或该载体呈线性化。

　　在原核系统中，起始密码子的选择几乎无一例外地依赖于核糖体结合位点(ribosomal binding site, RBS)的存在，这个位点包含了阅读框架的起始信号。经过优化的核糖体结合位点能够大大提高原核细胞内蛋白的表达。原核系统不识别位于ATG起始密码子上游的任何ATG，除非这些ATG含有一个处于合适位置的核糖体结合位点。

　　使用兔网织红细胞裂解物(Rabbit Reticulocyte Lysate, RRL)时，DNA介导的蛋白合成与mRNA为起始的蛋白合成相比较，具有以下优点：当进行高水平的蛋白合成时，不需要处理mRNA的繁杂操作过程。

基于真核细胞RNA的翻译

　　二十世纪九十年代，偶联的转录/翻译(即TNT®)系统被开发出来，该系统包含兔网织红细胞裂解物或麦胚提取物，并带有T7、T3或SP6 RNA聚合酶，这些系统使基于DNA的蛋白合成成为现实。

　　TNT®兔网织红细胞裂解物转录/翻译偶联系统(TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Transcription/Translation Systems)和TNT®快速转录/翻译偶联系统(TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems)仅需一个试管，即能够以质粒为模板转录和翻译蛋白(图2)。常规的TNT®偶联系统中的不同组分以单独包装提供，包括三种氨基酸混合物：甲硫氨酸缺失的混合物、半胱氨酸缺失的混合物或亮氨酸缺失的混合物。TNT®快速偶联系统提供一个混合母液，包含所有的反应组分(包括甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物)，减少了加样步骤，节约了时间。TNT® T7 PCR DNA快速系统(TNT® Quick for PCR DNA)是为PCR反应产生的线性DNA模板而特别设计，这样的模板比质粒DNA模板往往要求更高的钾离子和镁离子浓度。

　　对于真核细胞转录/翻译偶联反应，除兔网织红细胞裂解物之外，TNT®麦胚提取物系统(TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems)是又一个选择，后者也是单个试管的反应模式。普通的麦胚提取物通常是利用SP6, T3或T7 RNA聚合酶启动子在体外合成RNA，然后再进行翻译反应。与此不同的是，TNT®麦胚提取物系统将转录反应直接整合到翻译反应混合物中。

基于原核细胞RNA的翻译

　　E coli S30提取物系统(E coli S30 Extract Systems)是从E coli B菌株制备而来，该菌株中omp T 胞内蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失。这种缺失能够大大提高被表达蛋白的稳定性，否则，在细胞内表达的蛋白会被蛋白酶所降解。E coli S30提取物系统能够表达更多量的蛋白，这些蛋白在细胞内表达时，由于宿主编码的抑制剂的激活，这些蛋白的表达量很低。E coli S30提取物的DNA模板可以是线性的，也可以是环状的。线性DNA为模板的S30提取物(E coli S30 Extract System for Linear Templates,Cat# L1030)是从Ecoli B菌株中制备的，该菌株核酸外切酶V(recBCD enzyme)缺失。以线性DNA为模板的S30提取物比以环状DNA为模板的S30提取物(Ecoli S30 Extract System for Circular DNA, Cat# L1020)和T7 S30提取物(E coli T7 S30 Extract System for Circular DNA, Cat# L1130)的活性低。在使用这些系统时，研究人员仅需准备带有适当的原核细胞启动子和核糖体结合位点的克隆DNA即可。

　　以环状DNA为模板的E coli T7 S30提取物系统(Cat# L1130)简化了克隆在质粒或Lambda载体上的DNA序列的转录/翻译反应，该提取物中包含用于转录的T7 RNA聚合酶，以及翻译反应所需的所有必备组分。研究人员仅需提供带有T7启动子和核糖体结合位点的克隆DNA。

考虑因素— 蛋白产量

　　对于大多数体外表达系统而言，每50μl反应体系可产生皮摩尔级或纳克级的蛋白量。通常，该产量足够用于大多数的蛋白放射性分析、荧光分析以及抗体分析，例如聚丙烯酰胺凝胶分离、Western blotting、免疫沉淀；或者，也可进行酶学或生物活性的检测，这取决于目的蛋白的特性。如果是放射性检测，应在翻译反应体系中加入同位素标记的氨基酸，翻译反应结束后，可使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合放射性自显影来检测目的蛋白。或者，也可使用非放射性标记方法，如荧光法、化学发光法或比色法〔如，Promega的FluoroTectTM系统(Cat# L5001)和TranscendTM系统(Cat# L5070, L5080)〕。

　　如果拥有现成的目的蛋白的抗体，也可以使用免疫杂交或免疫沉淀的方法来进行检测。通常，从体外翻译反应得到的蛋白，其功能活性可在翻译反应混合物中直接进行检测。如果有必要纯化蛋白，可将目的蛋白与纯化标签融合，使目的蛋白便于从体外翻译反应体系中纯化出来，然后可进行进一步研究。

高产率的无细胞蛋白合成

　　如前所述，大多数无细胞表达系统所产生的蛋白量是有限的。用于表达真核细胞蛋白的麦胚提取物经过进一步修饰，能够提高蛋白表达量，可用于多种功能和结构蛋白质组学研究。SP6 TNT®高产率系统(TNT® SP6 High-Yield Wheat Germ Protein Expression System, Cat# L3260, L3261)使用高产率提取物，补充了SP6 RNA聚合酶以及其它组分。分批模式下，该系统可合成的蛋白量是100 μg/ml，使用透析模式时，可得到200–400μg/ml的蛋白。此外，可不经过蛋白纯化，即可在反应体系内直接进行酶活性的检测。通过亲和标签，可完成简便的纯化，仅需一步即告完成。也可经过微小的修改，在该体系内实现对目的蛋白的标记。

总结

　　无细胞表达系统能够帮助你完成蛋白的快速表达，产量足够用于下游实验。与细胞内表达相比，这些系统对毒蛋白的敏感度低；结合应用某些附加组分，如微粒体膜，可表达正确折叠的蛋白以及经过修饰的膜蛋白；同时，这些系统还可以在目的蛋白上掺入标记物或用于纯化的标签。Promega公司的无细胞蛋白表达平台为您提供进行蛋白研究所需要的多种产品选择。

tnt弹道轨迹中的宝物置换功能相信玩家们一定都很熟悉了吧~今天小编要为玩家们分享的就是tnt弹道轨迹宝物置换的一些攻略~一起来看看吧~

1、宝物使用价值评价：

一等：最通用(一般不用来置换)：鸟毛(连胜,道具等)，镜子，阿斯顿芯片

二等：特殊情况有用(如果你有需要,就可以留着以下宝物否则换成最通用宝物)：

风书(竞技风图,风息,复活模式可以考虑)

刀子(某些副本可以用，复杂的复活模式地图使用也不错,单挑可以考虑配合玫瑰)

计数器(刷副本，竞技配合玫瑰，寒冰飞镖，毒气筒使用)

节拍器(坦克模式配合钢炮秒人,远古剧场秒杀小小莫)

魔盒(配合盾牌等大招给力的武器)

三等：极少情况有用(如果你有需要,就可以留着以下宝物否则换成最通用宝物)

高抛秘籍：刷墓园，打水晶的黑化龙，刷无情谷等可以取代刀子计数器等

毒药(和飞镖等大招给力的武器搭配使用)

隐身斗篷(猥琐打法，机甲模式配合3隐身)

四等：被判了死刑的宝物，目前还未开发出使用价值(推荐置换成通用宝物)

表白信，亡者符文等

有潜力的宝物:

节拍器(某些方法避开虚弱阶段的打法正在被开发)

,不屈药剂,毒药(以后随着游戏发展血量增多)

等级越高越有优势的宝物(相比其他同等级的)：

不屈药剂：5级以上相比鸟毛可以防止对方冰2回合破护盾

龙牙(7级龙牙费血500后加成50%堪比镜子)

注意：以上推荐置换的宝物置换不能一概而论，根据置换品质选择置换方法，后面会提到。

2、购买宝物礼包：

随机宝物礼包开出镜子几率2%左右,精品宝物礼包开出镜子几率15%左右

追求质量买精品宝盒，宝珠多买随机(买随机较好)

是否购买置换宝珠：如果为了单一宝物,比购买宝物礼包划算得多

3、宝物置换中体现的品质：

置换规则：宝物有等级之分(通过大量置换总结出的)(和实际使用价值关系不大)置换时,容易换到同等级的宝物，很少可以换到高等级宝物,有时换到更烂的，D级是有机会置换出好东西的,只是浪费宝珠较多。

等级划分:

A类：狙击不死逆风不屈近身节拍计数次A：龙牙项链十字架斗篷

B类:毒药魔盒奥杜因秘籍

C类：血杯北境月亮阿斯顿飞行安氏沙漏

D类(此类严禁低等级置换镜子,白白浪费宝珠垃圾循环换垃圾,可以用来刷新转盘)：超爆红莲通缉符文表白半月

由于宝物置换会降低一个等级，1级的置换不会降低等级，所以

16个1级宝物可以换出16个镜子如果升级到3级再换，

就只有4个镜子只节省了3次置换使用的宝珠损失了12个宝物，

如果升级到4级再换,节省了12次置换使用的宝珠,损失了48个宝物

所以,是否合成为3级再置换取决于:

1对你来说3次置换使用的宝珠的价值是否大于12个宝物的价值

2对于A级宝物与D级宝物当然是要分开讨论,使用的宝珠数量相差10倍

是否合成4级,同理

(损失宝物只存在于1级合成2级的过程中2级以上合成是没有宝物损失的)

结论是

12个D级宝物的价值远远小于3次置换使用的宝珠的价值,所以往往合成之后再换

12个A级宝物的价值往往大于3次置换使用的宝珠的价值,所以1级置换

对于一般玩家来说,A级置换的宝物不要合成一个一个换,CD级(尤其是D级)合成到3级或者4级再置换

对于非常缺少宝珠的同学,BCD都可以合成较高等级再换

对于非常缺少宝物的同学ABC级都不合成,直接置换

最后考虑到每天刷出的镜子有限,所以推荐RMB玩家合成再换,可以迅速得到高级宝物

4、具体位置置换秘籍:

这种方法目前只是猜想,还无法论证

镜子只出现在置换轮盘的3个位置,特定位置用特定物品置换,能置换出镜子的几率较高

如果出现在第一行第2个:使用计数器

如果出现在第一行第3个:使用荆棘斗篷小刀

如果出现在第二行第3个:使用战刀项链

其他A级宝物没有位置限制

如果本条规律与其他规律相悖,优先服从其他规律

5、时间也会影响置换效率

如果A级宝物连续换到同一个东西第2次就要考虑用别的A级东西换

如果A级换到C,D级的东西立刻要用别A级的换

潘多拉，垃圾宝物，全看人品。55几率抽到好东西（急救包，无损跟踪，隐嘛身，减少伤害50%）负面有虚弱（无法加成）至盲（无法攻击，可以飞行）缠绕（无法移动和飞）忘了（导弹会瞄准你）…伯恩的计数器（没打一炮加成1%上限25%）劳尔的狙击镜（离得越远，攻击越好）近身战刀（相反）阿斯顿的芯片（连续两回个没有击中对手，从第三回个开始，没回个恢复最大生命值的7%）强烈节拍器一回合增加50点攻击，三回合减少几点。主要这几个好。

我用手机打的，楼主体谅我啊。

TNT平台中的开发平台是基于微软Jupiter平台的快速开发工具，开发者可以通过界面属性设定的方法来完成对业务系统的快速开发，自动化生成C#和JAVA的二种语言的系统。

基本介绍 中文名 ：TNT平台 性质 ：开发工具 平台的特点,平台套用, 平台的特点

TNT平台的特点是既提供软体开发平台，又提供基于该平台生成的各种套用系统和原始码，三种产品相辅相成，实现“标准化+行业化+个性化”的套用模式。

TNT平台并不是独立销售的，而是集成了标准化软体的功能，如OA、CRM、进销存、文档管理、契约管理等模组。对最终用户和软体服务商来说，他们既可以单独采购这些标准化的软体，又可以采购软体+平台的套装，用以满足自己的通用化需求或个性化需求。 平台套用 TNT平台包括三部分的套用： 1）T——Tooles，开发工具 针对相关的业务系统模板和开源组件包，亚思捷软体提供了开发工具Tools： Jupiter业务基础平台。Jupiter业务基础平台是亚思捷软体的核心开发人员集超过200多人年的套用系统开发经验，结合软体开发主流技术和趋势，自主研发的套用系统原始码自动生成工具，使用人员通过界面属性设定的方法来完成对业务系统的快速开发，自动化生成C#和JAVA的二种原始码及相关文档。Jupiter定位于套用管理软体业系统原始码的快速生成工具，特别适合以数据表单+流程的套用管理软体业务系统的开发。 2）N——Nucleus，开源组件包 亚思捷软体推出开源组件包Nucleus，即可以为合作伙伴提供所有业务系统模板的原始码。开源组件包将适合于面向有一定开发能力的合作伙伴。开源组件包将打破传统软体产品及服务的限制，让最终客户得到更高质量、更低成本、更易用的套用管理软体解决方案。 3）T——Templates，业务系统模版 基于开发工具和开源组件包，生成的各种办公管理系统，可以直接提供给客户使用，包括办公管理系统（OA）、文档管理系统（DMS）、客户管理系统（CRM）、线上考试系统（ONES）、企业信息门户、人力资源管理系统（HR）、办公资产管理系统、采购管理系统、工程管理系统、绩效考核管理系统。

你好！

tnt的高会是指加入时代少年团粉丝俱乐部的成员，加入俱乐部的费用为298元一年

里面分为几个模板有

TNT的窝在里面可以了解最可爱的他们

TNT的写真看到那些官方没发在微博上的图

TNT的语音可以听到他们读的粉丝来信

加入高会后还可以写信给他们，他们看到了会回复，还有想要去观看演唱会的也要充值高会才有邀请码购买演唱会的票